Interchim® propose dans sa gamme puriFlash® deux appareils dédiés à la purification de peptides et oligonucléotides, le 5.125P (250 mL/min @ 125 bar) et 5.250P (12 5mL/min @ 250 bar). Ces deux appareils se distinguent des autres par 2 facteurs :
- Une cellule UV avec un trajet optique 1,3 mm, permettant l’acquisition d’un signal plus important
- Leurs tubings ont des diamètres internes réduits 1 mm pour le 5.125P et 0,75 mm pour le 5.250P
Dans cet article, nous nous intéresserons au système de purification 5.250P. En effet, avec un diamètre interne (ID) de 0,75 mm cet appareil offre un panel d’applications particulièrement adapté à la purification en phase inverse des molécules que sont les peptides et oligonucléotides.
Cellule UV à trajet optique plus important
Le point le plus évident, concerne la cellule UV, avec un trajet optique de 1,3 mm (contre 0,3 mm sur d’autres systèmes de purification) qui permet une augmentation du niveau du signal.
D’après la loi de Beer-Lambert (A=ε l c, A : absorbance, l : longueur du trajet optique, ε : coefficient d’extinction), en multipliant le trajet optique par 4, l’absorbance sera augmentée. Nous avons donc un premier paramètre qui permet une meilleure observation d’impuretés car leur signal sera plus important.
Réduction du diamètre interne
Nous allons, au travers d’une application, montrer un autre avantage lié à la réduction du diamètre interne et d’un trajet optique plus important.
Application :
Solutés : Uracile, Toluène, Naphtalène
Colonne : PF-5C18HP-150/212
Quantité injecté : 100 µL
Solvant : Eau / Acétonitrile (30/70)
Temps méthode : 9 min
Détection : 254 nm
Système avec tubing ID 1,6 mm et cellule UV 0,3 mm
PuriFlash® 5.250P (tubing ID 0,75 mm, cellule UV 1,3 mm)
Superposition des deux chromatogrammes
Comparaison intensité de signaux sur colonne 5 µm, 150 x 21,2 mm
En orange donc, le chromatogramme obtenu avec le système PuriFlash® 5.250P
La différence est flagrante entre les deux chromatogrammes. La même méthode a été réalisée, on remarque deux avantages :
- La hauteur des pics est beaucoup plus importante avec le puriFlash®5.250P
- La diffusion des pics est réduite avec le puriFlash®5.250P
Les deux éléments nous montrent qu’il est plus facile de visualiser des impuretés en petite quantité et de les séparer. Il sera ainsi plus facile de séparer une impureté, en petite quantité, très proche d’un composé intense.
Autre avantage : utilisation de colonnes de diamètre interne 4,6 mm
Un autre avantage peut être pris en compte. L’utilisation de colonne avec un diamètre interne de 4,6mm.
On dispose alors d’un système permettant de développer une méthode analytique, puis de transposer directement sur colonne préparative ou Flash, en s’affranchissant des problèmes liés aux différents volumes morts entre machine.
Application :
Solutés : Uracile, Toluène, Naphtalène
Colonne : PF-5C18HP-150/P46
Quantité injecté : 10 µL
Solvant : Eau / ACN (30/70)
Méthode : 15 min
Détection : 254 nm
ID Tubing 1.6 mm, cellule UV 0,3 mm sur colonne PF-5C18HP 250 x 4,6 mm
ID tubing 0,75 mm, cellule UV 1,3 mm sur colonne PF-5C18HP 250 x 4,6 mm
Superposition des deux chromatogrammes
Comparaison intensité signaux colonne 4,6 mm
De la même façon, l’intensité des pics détectés est plus élevée sur un système avec volume mort réduit, mais la différence la plus importante, est la diffusion des pics. Avec des tubings ID = 0,75 mm, les deux pics à 9 min et 11 min sont bien mieux séparés.
Le système 5.250P permet donc d’envisager un développement sur colonne analytique avec un ID de 4,6 mm.
Un développement analytique et une purification sur le même système
Puisqu’il est possible de développer une méthode analytique, la transposition sur colonne préparative ou Flash peut se faire facilement. L’avantage ici est donc de pouvoir développer et purifier sur le même système.
Colonne 250 x 4,6 mm, 5 µm, C18HP
Colonne 150 x 21,2 mm, 5 µm, C18HP
Résumé :
Le puriFlash® 5.250P est un appareil parfaitement approprié aux purifications difficiles que sont les purifications de peptides et oligonucléotides.
Cet appareil vous permettra :
- d’obtenir un signal plus intense grâce à une combinaison de cellule UV, avec un trajet optique plus important, et d’une réduction de volume mort (ID=0.75mm) pour repérer plus facilement les impuretés en petite quantité.
- d’utiliser des colonnes remplies avec une phase 5µm pour des purifications difficiles
- d’utiliser des colonnes analytiques
- de transposer directement depuis une colonne analytique vers une colonne préparative ou Flash directement sur le même appareil.
En savoir plus :
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